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生物学 尿源性干细胞的生物学剖析及其运用

2019-05-15 11:33:38来源:组稿人论文网作者:婷婷

  Zhang等于2008年初次从尿液中别离出一类具有祖细胞特性的细胞, 随后证明这类有祖细胞特性的细胞是干细胞, 并命名为尿源性干细胞 (urine-derived stem cells, USCs) .USCs是一类增殖才能强, 具有多向分化才能, 能分化成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞, 可取自体细胞用于治疗, 无免疫原性, 不受伦理限制的细胞.这种来源无创、操作烦琐的细胞一经发布就遭到许多研讨团队的关注。尿液只需屡次混合磷酸盐缓冲液 (PBS) 、离心便能够从中取得USCs.目前从正常人或患各种肾小球疾病的患者中都能胜利别离细胞, 在蛋白尿中胜利别离到细胞的概率更高;可获取USCs的人群年龄跨度可重新生儿 (出生后28 d内) 到50岁;最少可取5 ml尿液停止别离。这类干细胞不只可从安康人及患者身上取得, 也可从多种动物身上取得, 如恒河猴、猪和新西兰大白兔等, 具有来源普遍的特性, 便于后续实验研讨的展开。目前在人体中的研讨显现, USCs可能来自上尿道, 包括肾脏、肾盂、输尿管。从上尿道中别离的干细胞和排泄尿中别离出的细胞分歧, 这也减少了USCs组织来源的研讨范围。Kang等[6]对同一位患者的脂肪干细胞和USCs在生物学特性方面停止了比拟研讨, 结果显现, USCs比脂肪干细胞具有更强的增殖才能, 都具有低免疫原性, 可停止同种异体移植;并且USCs向肌细胞、神经细胞和内皮细胞分化才能更强, 这也提示USCs可能来源于外胚层或者中胚层。

  1、尿液中的细胞类型及USCs的获取

  尿液是人体代谢产物, 包含尿素、尿酸及无机盐等物质, 也包含组织零落的细胞。但凡参与尿液构成过程的器官组织都有可能零落细胞到尿液中。零落到尿液中的细胞包含足突细胞、肾小球壁细胞、近曲小管细胞、远曲小管细胞、肾小管上皮细胞、尿道上皮细胞及基内幕胞、膀胱上皮细胞及基内幕胞、尿道括约肌细胞以及干细胞等。

  早在20世纪60年代, Sutherland等就重新生儿尿液中培育细胞, 他们培育出的细胞和羊水中培育出的细胞形态极为类似;羊水中的细胞可能来自婴儿的皮肤、呼吸系统等, 也有可能来自婴儿的尿路系统。所培育的细胞也是一类异质性的细胞群体。

  壁细胞和足突细胞散布于肾小球构造中, 发挥着重要的生理功用。Kabgani等对壁细胞和足突细胞的细胞形态构造停止了大量研讨, 发现它们十分类似。壁细胞以长梭形或多角扁平的鳞状为主, 具有构成板状伪足的潜能。而足突细胞则显现出两种不同的细胞形态, 初始是扁平状细胞, 胞浆从核的四周呈辐射分叉状, 这一特性与壁细胞极端相似。足突细胞随后会阅历从相似壁细胞形态向足突细胞形态转化的过程。足突细胞是终末分化的细胞, 体外培育简直不再停止团结, 而壁细胞则终身都处在团结更新的状态。肾小球壁细胞和足突细胞的祖细胞都是肾素系 (renin lineage) 细胞.

  尿液中还可能呈现尿道上皮细胞以及肾小管上皮细胞, 它们在体外培育时具有一定的增殖分化才能[10].尿道上皮细胞克隆呈现出不规则的轮廓线, 能够体外传代达6代之多, 并表达细胞角蛋白-7 (cytokeratin-7) .肾小管上皮细胞则呈现鹅卵石样形态, 并表达碳酸酐酶 (carbonic anhydrase) .Rahmoune等[11]胜利从安康人和2型糖尿病患者尿液中别离和连续培育近曲小管上皮细胞, 并作为研讨糖尿病患者肾中葡萄糖转运的人细胞模型。他们从尿液中别离的近曲小管上皮细胞与活检的肾组织细胞表达类似的标志物, 如CD13/氨肽酶-N (aminopeptidase-N) , 碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase) , 钠-葡萄糖协同转运蛋白2 (sodium-dependent glucose transporters 2, SGLT-2) .尿液生成后暂时贮存在膀胱中。膀胱是一个空的球体, 膀胱上皮由3个细胞层组成, 每个细胞层都有不同的细胞形态。基底层的细胞直径为5~10μm, 中间层细胞大约是20?m, 最上层的伞状细胞是六边形, 依据膀胱延展度测算, 直径为50~120μm.膀胱上皮细胞的自我更新经证明是由基内幕胞层交融构成中间细胞层、再交融构成伞状细胞层完成的, 其中伞状细胞的胞质有高密度的胞浆颗粒, 这可能和细胞骨架细纤维构造的存在有关.

  USCs是组织工程中极具应用前景的种子细胞, 其获取是研讨的根底。Schosserer等树立了一套规范的从人尿液中别离USCs的办法。他们采用Bharadwaj等报道的p USCs培育基 (primary urine cells culture medium) 培育细胞时发现, 从男性尿液中胜利别离USCs的概率要比女性高 (70%比42%) , 并且发现, 不论男女, 每个人都能够从尿液中取得细胞。这提示我们每个安康人的尿液中都能够胜利别离USCs.他们还对4种不同培育基停止优化挑选, 结果都能取得USCs, 但采用p USCs培育基培育细胞时, 有最高的群体倍增数量;EGM-2培育基培育时群体倍增数量少, 提示EGM-2并不是培育USCs的最佳选择。值得留意的是, 从将原代细胞种植在胶原上能否能促进其别离培育的探究中发现, 没有铺胶原的培育皿培育出的原代细胞克隆数目比铺胶原的明显增加。总结起来, USCs能够用不同的培育基培育, 但用p USCs培育基且不铺胶原关于USCs扩增是最高效的。

  2、USCs的异质性及来源

  人的间充质干细胞是一类异质性的细胞群体, 这也反响在其各种不同的细胞形态以及生物学特性上.Zhou等也发现尿液中有两种形态的细胞, 命名为I型和II型。间充质干细胞或祖细胞都存在亚群, 如骨髓间充质干细胞 (BMSCs)、羊水干细胞 (AFPCs) 、脐带血干细胞 (UCBSCs) .有学者对这些干细胞或者祖细胞亚群的生物学特性停止了研讨, 以期找到最为适宜的细胞用于细胞治疗.有趣的是, 它们的亚群都呈现出长梭形和圆形两种形态。USCs自从被Bharadwaj等证明后, 已有多个研讨USCs生物学特性的报道, 结果显现, 不同研讨组察看到的USCs形态并不分歧, 这提示USCs并不是一类单一的细胞群体。Bharadwaj等研讨了来自上尿道的尿液中干细胞的生物学特性, 从形态上看, 细胞呈谷粒状, 折光度较高;在他们发布的后续研讨中细胞仍然呈谷粒状。但是Guan等的研讨显现USCs呈长梭形的成纤维样形态。而本来尿液来源细胞的形态从上皮样到长梭形的成纤维样都存在。Schosserer等在研讨中将细胞连续传代至3代, 细胞呈现均一的长梭形后再用于后续实验, 若仍是异质性的则舍弃。这也提示尿液中存在着不同类型的细胞, 谷粒状折光度较高的细胞和长梭构成纤维样的细胞有可能都是USCs.这使得停止深化研讨USCs时面临一个难题, 即USCs的异质性, 特别是在当今细胞治疗的标准化流程管理下, 这个问题就愈加突出, 弄清这个问题也显得尤为必要。

  USCs的异质性也与其来源亲密相关。尿液构成过程中有诸多器官与组织参与。每一种组织中都存在干细胞或者祖细胞, 这使得USCs的来源有了诸多可能性。搞分明USCs的来源对我们了解尿路系统中多能间充质干细胞的生物学作用将会有更好的协助。

  由于从上尿道尿液中别离的细胞在细胞表型、分化才能上都具有干细胞的生物学特性, 这就使得USCs的来源能够减少到上尿道范围内。它有可能来自肾小球内腔上皮, 追根溯源可能是肾小管或肾乳头。肾小球内腔上皮细胞具有自我更新的才能, 也能生成足状突细胞和临近的管细胞.内皮干性的转变是内皮细胞的细胞极性转变成间充质干细胞的一个过程;这种多潜能基质细胞可以分化成各种细胞修复和再生肾脏。从肾组织活检中很容易取得内腔细胞, 但要别离纯的内腔细胞仍然比拟艰难.

  此外, 一位承受了男性来源的肾移植手术的女性的USCs包含有Y染色体, 也表达正常肾细胞外表标志物 (PAX2和PAX8) , 足状突细胞、肾小球内腔细胞的特异性基因及蛋白质标志物 (synaptopodin和podocin), 提示USCs极可能来源于肾。更重要的是, USCs表达的CD146+/CD31-与肾内腔细胞和足状突细胞的表达类似, 而肾小管内皮细胞、膀胱和泌尿道上皮战争滑肌细胞则不表达, 也暗示USCs是一种移行性细胞, 很有可能来自肾脏组织的内腔细胞和足状突细胞.

  3、USCs的生物学特性

  3.1 USCs的自我更新才能

  USCs可从废弃尿液中取得, 并能从单个细胞构成数量庞大的细胞群, 有足够的端粒酶长度和高端粒酶活性.新颖尿液中取得的USCs均匀群体倍增的倍数到达49.5±7.2, 提示单个USCs在14周内能生成267个细胞, 在若干次传代后都显现出正常细胞核型。

  3.2 USCs的多向分化潜能

  USCs在体外可以分化成多种细胞, 经适宜的诱导培育基诱导后, USCs可诱导分化成各品种型的细胞, 其在基因程度、蛋白程度和细胞程度各自表达成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞和内皮细胞的特异性标志物。植入体内后, 诱导后的USCs能够构成功用性骨、软骨、脂肪、肌肉、内皮和尿道组织。

  在输尿管、膀胱或者尿道组织工程研讨中, 泌尿道上皮细胞、内皮细胞战争滑肌细胞关于构成泌尿道上皮黏膜、血管和肌肉层是必需的。但是, BMSCs或者脂肪间充质干细胞 (ADSCs) 在泌尿道组织再生过程中构成泌尿道上皮细胞是一个难题, 常用的BMSCs能够分化成平滑肌细胞和内皮细胞, 但只要5%~10%的BMSCs表达泌尿道上皮细胞基因和蛋白标志物.其缘由可能是要使基质细胞 (中胚层) 分化成泌尿道上皮细胞 (内胚层) 简直是不可能的。

  USCs能够分化胜利能性的平滑肌细胞.USCs分化的肌细胞在基因程度和蛋白程度都表达α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 、肌间线蛋白 (desmin) 和肌球蛋白 (myosin) .在不同培育基中, 随着时间推移, 这些标志物在m RNA程度和蛋白程度都呈现明显的增加。

  采用USCs培育基停止培育, 转染成纤维细胞生长因子2 (FGF2) 的USCs与未转染FGF2的USCs都能向内皮细胞分化, 表达内皮细胞特异性的基因和蛋白标志物-CD31、血管性血友病因子 (v WF) 和内皮型一氧化氮合酶 (e NOS) , 构成具有屏障功用的内皮细胞, 利于早期血管构成;诱导的USCs移植到2型糖尿病大鼠皮下4周后有重生血管构成.

  3.3 USCs分泌营养因子和外源性生长因子

  USCs能够分泌外泌体 (exosomes, exo) , 减轻1型糖尿病大鼠早期肾衰竭。经多个实验结合证明其机制是由于外泌体抑止了足突细胞的凋亡, 同时又促进了血管生成。与细胞相比, USCs-Exo引发人体免疫排挤反响的可能性极小。USCsExo可持续稳定地供给, 将会是再生医药范畴中极具前景的治疗方式。

  4、USCs的应用研讨

  4.1 USCs与泌尿道系统修复

  外伤、肿瘤、神经源性膀胱、某些先天性膀胱疾病等均可招致膀胱缺损, 需求修复重建膀胱, 这是临床难题之一。小肠黏膜下层 (small intestinal submucosa, SIS) 是组织修复研讨中较为成熟的生物资料。SIS是一种源于小肠的脱细胞基质资料, 具有自然胶原三维多孔构造和生物力学性能, 利于细胞的黏附增殖以及植入应用[50].有研讨将由USCs分化而来的尿路上皮细胞 (urothelial cells, UCs) 战争滑肌细胞 (smooth musle cells, SMCs) 种植至SIS支架上, 植入裸鼠皮下, 组织学检测结果显现, UC-USCs表达UCs特异性标志物AE1/AE3和uroplakin-III, SMC-USCs表达SMC特异性标志物α-SMA、desmin、和myosin, 胜利构建出相似自然膀胱组织的构造.Bodin等采用相同办法将USCs源性UCs和SMCs种植至细菌纤维素 (bacterial cellulose, BC) , 最终也取得了与正常机体膀胱壁构造类似、可进一步用于膀胱修复研讨的修复资料。

  括约肌、神经中枢、尿道血管等损伤都会招致应激性尿失禁。有研讨讨论了过表达血管内皮生长因子 (VEGF) 对USCs植入裸鼠后血管生成、细胞存活率、细胞生长、肌肉表型的分化以及神经生成状况的影响[51].研讨者用载有人VEGF165和绿色荧光蛋白基因的腺病毒感染USCs, 与人骨骼肌母细胞 (作对照) 悬浮于I-型胶原凝胶上植入到裸鼠体内, 结果标明, 过表达VEGF能使USCs在移植后促进血管化, 细胞存活率增加, 促进USCs肌细胞表型分化和神经散布。该办法关于细胞治疗用于应激性尿失禁的临床治疗具有重要的指表示义。

  4.2 USCs与骨修复

  Guan等[52]将USCs种植在可降解的β-磷酸三钙 (beta-tricalcium phosphate, β-TCP) 上, 在体外骨诱导培育基中培育7 d, 然后用于小鼠骨组织缺损修复, 结果显现预后效果明显较对照组好。同年他们发表了另一项研讨成果:将骨形态发作蛋白 (BMP) -2基因转入USCs, 在体外无需成骨诱导培育基, USCs即可自分化为成骨细胞;植入裸鼠体内6周后取材停止考证, 发现有人源性的OCN (osteocalcin) , 提示移植的细胞不只存活, 而且在植入原位刺激骨生成。这项研讨中采用的是无血清培育基, 这为USCs未来应用于临床治疗奠定了根底。

  4.3 USCs与糖尿病性勃起功用障碍

  比起其他的间充质干细胞, 不管是USCs还是经FGF2修饰过的USCs, 关于2型糖尿病性勃起功用障碍都有改善作用.将从安康捐献者的尿液中搜集到的USCs和转染了FGF2的USCs (USCs-FGF2) 植入到海绵组织中, 察看1周和4周, 植入USCs和USCs-FGF2后海绵内压力 (ICP) 有明显增加, 并且比28 d的均匀动脉压力有更高的增率。虽然原位上很少探测到植入的细胞, 但经过组织学和蛋白印迹剖析可证明, USCs或者USCs-FGF2植入后, 海绵组织中内皮细胞战争滑肌细胞的标志物表达更高。这个研讨证明USCs和USCs-FGF2的旁分泌起到了招募2型糖尿病小鼠本身细胞从而增加内皮细胞战争滑肌细胞的数量的作用。

  4.4 USCs促进伤口愈合

  虽然伤口愈合技术已有十分大的进步, 但仍需求新的治疗战略来改善治疗效果。有研讨评价了USCs和聚己内酯/明胶 (PCL/GT) 改造的新型生物资料对伤口愈合的潜在用处, 即采用双喷嘴静电纺丝将PCL和明胶溶液在有机溶剂中旋转制造PCL/GT复合网格, 并对PCL/GT膜的形态和亲水性做了评价[53].其将安康个体别离USCs接种到PCL/GT上后, 检查细胞黏附、形态、增殖和细胞毒性, 然后将USCs接种在PCL/GT混合纳米纤维膜上, 并移植到兔全层皮肤缺损中以停止伤口修复。PCL/GT膜具有与皮肤组织类似的机械性能, 具有良好的生物相容性。与单独运用PCL/GT膜或未治疗的伤口相比, USCs-PCL/GT显着加快兔全层皮肤伤口愈合, USCsPCL/GT治疗的伤口闭合得更快, 上皮化、胶原构成和血管生成加强。此外, USCs能够分泌VEGF和转化生长因子-β1 (TGF-β1) , 并且USCs条件培育基可加强内皮细胞的迁移、增殖和血管构成。该研讨应用USCs治疗, 提供了一种加速伤口闭合和促进血管生成的新战略。

  此外, 还有研讨提出了一种简单有效的办法, 即经过用生物玻璃 (bioglass, BG) 离子产物激活USCs来进步USCs的伤口愈合才能.BG激活的USCs增加了USCs和受体细胞之间的旁分泌作用, 这促进了内皮细胞毛细血管网络的构成, 并刺激成纤维细胞的细胞外基质蛋白质的产生。此外, BG激活的USCs还能够刺激成纤维细胞和内皮呼吸之间的旁分泌作用。因而, 在细胞治疗中, 用生物活性物质激活干细胞可能是进步干细胞再生才能的重要办法。

  5、USCs研讨中有待处理的问题

  在USCs的研讨中, 尚存在一些有争议的假定。虽然研讨模仿了植入细胞的存活率, 以及在组织修复过程中干细胞分泌生长激素和生长因子的作用, 但转分化和旁分泌在各种组织再生过程中能否都起到了关键的作用还有待研讨。

  其次, 能否需求引入外源性的生长因子来为促进血管生成提供营养支持也有争议。有些组织自身具有丰厚的血供, 比方膀胱。而在只是小局部组织修复时, 生长因子的参加有可能给治疗带来一定的风险。

  另外, USCs培育周期长, 在体外培育时需求6~7周才干到达亿个细胞量.这是由于初次呈现细胞克隆的时间较长, 均匀在第8天呈现第1个克隆, 且克隆数量较少, 1份样品中只要1~3个克隆, 初次传代通常在14 d左右.而组织工程修复需求大量的细胞。例如用细胞治疗修复膀胱大约需求1.4×109个细胞, 这对USCs将来应用于临床是一个限制。如何缩短细胞培育周期, 在更短时间内到达临床细胞用量是一个值得思索的问题。采用树立细胞库的办法, 缩短培育周期, 到达随用随取, 或许是一种处理办法。

  USCs目前的研讨还处在初期阶段, USCs在别离效率上还有待进步, 特别是从患者尿液中别离USCs还有待更多的研讨。USCs也存在别离失败的可能性, 假如不能取自体细胞用于治疗, 那么关于同种异体USCs免疫相关的全面评价则更有待深化研讨。

  6、小结

  总之, USCs易获取且增殖才能强, 不只能有效分化成足状突细胞、肌细胞、内皮细胞和泌尿道细胞, 还能分泌生长因子, 在组织再生方面是极具应用前景的种子细胞, 特别是泌尿道生殖器的组织修复。用USCs在治疗糖尿病性勃起障碍, 应激性尿失禁, 尿道、膀胱重建和肾功用缺乏的模型中均显现有较好的临床应用价值。USCs除了能够应用于泌尿道生殖器组织修复, 还可能成为治疗其他系统组织损伤或疾病的有效细胞来源。但目前USCs的各项研讨尚仍处于初期阶段, 还需做大量科研工作去处理存在的诸多问题。

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